郁闷症临床表现为显着而耐久的心境失落、思想愚钝、认知功用危害、毅力活动削弱等 [1] 。在世界规模内，郁闷症已成为患者担负最严峻的疾病之一 [2] 。现在临床抗郁闷药物以化学药为主，其优势在于起效较快、效果切当，缺少在于不良反响较大，患者对药物存在依赖性，复发率较高，而中药的药效安稳且不良反响少，安全性高 [3-4] 。因而从中药中开掘潜在的抗郁闷药物具有重要意义。菊花是药食同源的典型植物，具有较好的医疗保健成效，在我国的文字记载中已经有 4000 年的前史 [5] 。 Wu 等 [6] 研讨发现，菊花提取物可以减轻缓慢不行预知的温文应激（ chronic unpredictable mild stress ， CUMS ）诱导的小鼠模型中的郁闷样行为，一起对下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（ hypothalamic pituitary adrenal ， HPA ）轴的过度活泼和促炎细胞因子的表达有按捺效果。现代药理学研讨证明，怀菊花有较好的抗菌、降压、抗氧化等效果 [7] 。本课题组在对河南产中药进行抗郁闷活性挑选时发现怀菊花具有较好的抗郁闷效果，因而本研讨选用体表里郁闷模型，研讨怀菊花的抗郁闷效果以及其或许的效果机制。
SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠，体质量 18 ～ 22 g ，购自北京维通利华试验动物技能有限公司，许可证号 SCXK （京） 2016-0006 。动物养殖于 18 ～ 22 ℃清洁级动物试验室内，空气流通， 12 h 光照，昼夜循环，自在进食饮水。动物试验经河南中医药大学试验动物道德委员会同意（同意号 DWLL2018080003 ）。
怀菊花收购于焦作武陟，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为菊科植物菊 Chrysanthemum morifolium Ramat. 的枯燥头状花序。
2.1.1怀菊花提取物的制备 称取怀菊花 1 kg ，参加 10 倍量水，煎煮 3 次，每次 1 h ，纱布滤过，兼并滤液，减压浓缩枯燥，称定质量，核算提取率为 28.0 % 。取怀菊花水提物 4.5 mg 于锥形瓶中，参加 10 mL 蒸馏水，超声提取 30 min ， 1200 r/min 离心 10 min ，取上清液于进样小瓶中，进行 UPLC-Q/TOF-MS 剖析。
2.1.2对照品溶液的制备 精细称取芹菜素、柚皮素、香叶木素、金合欢素、木犀草苷、咖啡酸、绿原酸、木犀草素对照品适量，至 10 mL 量瓶中，加蒸馏水定容，得到质量浓度为 0.1 mg/mL 的对照品溶液。精细汲取上述各对照品溶液 1 mL ，加蒸馏水定容至 10 mL ，得到混合对照品溶液。
2.1.4质谱条件 选用电喷雾离子源（ ESI ），在正离子形式下进行检测，扫描规模 m /z 50 ～ 1000 ；离子源能量为 3.0 eV ；磕碰能量为 5.0 eV ；毛细管电压为 3.5 kV ；去溶剂气为 N2 ；去溶剂气体积流量为 8.0 L/min ；脱溶剂气温度为 230 ℃。
2.2.1动物模型的树立、分组及给药 C57BL/6 小鼠习惯性喂食 3 d 后，依据体质量均衡准则随机分为对照组、模型组、氟西汀（ 5 mg/kg ）组和怀菊花提取物低、中、高剂量（ 1.67 、 3.33 、 6.67 g/kg ）组，每组 8 只。模型组和各给药组 sc 皮质酮（ 20 mg/kg ），对照组 sc 等体积生理盐水， 1 次 /d ，接连 21 d[8] 。造模一起，各给药组 ig 相应药物（ 20 mL/kg ）， 1 次 /d ， 接连 21 d 。
（1）糖水偏好试验： 末次给药完毕后， 小鼠单笼养殖，并放入 2 瓶含 1% 蔗糖的水溶液， 24 h 后将其间 1 瓶换成纯水， 12 h 后互换 2 个水瓶方位，再养殖 12 h ，习惯期完毕后，将小鼠禁食禁水 24 h ，之后进行基线测验。在鼠笼上放置已称定质量的 2 个瓶子，别离为含 1% 蔗糖的水溶液与纯水，小鼠禁食 12 h 后，取下瓶子，记载 2 个瓶子的液体消耗量，核算糖水偏好率 [9] 。
（2）悬尾试验：在小鼠尾部三分之一处固定，悬挂于支架上，使小鼠头部间隔台面 15 cm ，习惯 1 min 后记载小鼠 5 min 内的不动时间 [9] 。
（3）自主活动测定：将小鼠放到自主活动箱中，盖上闭光板，习惯 2 min 后，记载 5 min 内小鼠的站立次数和活动次数 [9] 。
2.3.3流式细胞术检测细胞 ROS 水平 按“ 2.3.2 ”项下办法进行分组和给药，处理 24 h 后，弃去上清液，用 PBS 清洗后，装载探针，用培养液洗去剩余探针，胰酶消化后，搜集细胞，重悬，上机检测 [11] 。
2.3.4In-Cell Western 法检测凋亡通路和 CREB 通路相关蛋白表达 按“ 2.3.2 ”项下办法进行分组和给药，处理 24 h 后，搜集细胞，顺次进行固定、透化，于 5% 脱脂牛奶中关闭 1.5 h ，别离参加一抗（ 1 ∶ 100 ）， 4 ℃孵育过夜； PBST 洗刷 5 次， 5 min/ 次，参加二抗，孵育 1 h ； PBST 洗刷 4 次， PBS 洗刷 1 次后显影，运用双色红外激光成像体系进行检测和剖析。
用 SPSS 26.0 计算软件进行剖析，数据用 标明，组间比较选用单因素方差剖析。
如图 1 所示，怀菊花提取物中含有芹菜素、柚 皮素、香叶木素、金合欢素、木犀草苷、咖啡酸、 绿原酸和木犀草素。
如图 2 所示，与对照组比较，模型组小鼠糖水偏好率显着下降（ P ＜ 0.01 ），悬尾试验不动时间显着添加（ P ＜ 0.01 ），自主活动数和站立次数显着削减（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；与模型组比较，各给药组小鼠悬尾试验不动时间显着削减（ P ＜ 0.01 ），站立次数显着添加（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；氟西汀组和怀菊花提取物低、中剂量组小鼠糖水偏好率显着升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；怀菊花提取物低剂量组小鼠自主活动数显着添加（ P ＜ 0.05 ）。
如图 3 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中皮质酮水平显着升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，氟西汀组和怀菊花提取物低、中剂量组小鼠血清中皮质酮水均匀显着下降（ P ＜ 0.01 ）。
如图 4 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清 中 5-HT 、 DA 、 Ach 和 NE 水均匀显着下降（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中 5-HT 水平显着升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），氟西汀组和怀菊花提取物低剂量组 DA 水平显着升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），氟西汀组和怀菊花提取物低、中剂量组 Ach 水平显着升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），怀菊花提取物中剂量组 NE 水平显着升高（ P ＜ 0.05 ）。
如图 5 所示，与对照组比较，模型组小鼠胸腺指数显着下降（ P ＜ 0.05 ），其他脏器指数无显着改变；与模型组比较，各给药组小鼠脏器指数均没有显着改变。
3.6怀菊花提取物对皮质酮诱导的郁闷小鼠海马安排CREB通路要害蛋白表达的影响
如图 6 所示，与对照组比较，模型组小鼠海马安排中 CREB 、 p-CREB 、 cAMP 和 BDNF 蛋白表达水均匀显着下降（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；与模型组比较，怀菊花提取物低、中剂量组小鼠海马安排中 CREB 和 cAMP 蛋白表达水平显着升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），怀菊花提取物低剂量组 小鼠海马安排中 p-CREB 蛋白表达水平显着升高（ P ＜ 0.01 ），氟西汀组小鼠海马安排中上述蛋白表达均无显着改变。
如图 7 所示，与对照组比较，模型组细胞存活率显着下降（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞存活率均显着升高（ P ＜ 0.01 ），怀菊花提取物质量浓度为 100 μg/mL 时效果最佳。
如图 8 所示，与对照组比较，模型组活细胞数显着下降（ P ＜ 0.01 ），凋亡和坏死细胞数显着升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组活细胞数显着升高（ P ＜ 0.01 ），凋亡和坏死细胞数显着下降（ P ＜ 0.05 、 0.01 ） 。
如图 9 所示，与对照组比较，模型组细胞内 ROS 水平显着升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞内 ROS 水平显着下降（ P ＜ 0.01 ）。
3.11怀菊花提取物对皮质酮诱导的PC-12细胞CREB通路要害蛋白表达的影响
跟着社会的不断发展，人们的精神压力越来越大，郁闷症患者数量逐年上升。据世界卫生安排陈述， 2017 年全世界有超越 3.22 亿郁闷症患者，并且这个数字一直在添加 [12] 。中医虽无郁闷症病名，但依据郁闷症临床表现在古籍中找到脏躁、梅核气、奔豚气、郁证、百合病等相关病名 [13] 。现在对郁闷症发病机制的研讨首要会集在神经递质及其受体假说、神经养分假说、神经免疫假说、神经可塑性假说、信号转导通路体系反常假说和神经 - 内分泌假说 。研讨发现，郁闷症的产生与糖皮质激素有亲近关系，当机体处于长时间应激状态， HPA 体系继续兴奋，会产生很多的糖皮质激素，经过血脑屏障入脑，易与海马安排中神经元的糖皮质激素受体结合产生神经毒性，形成海马萎缩 [9] ，而海马参加心情的操控和反响，对心情反响起非特异性按捺效果。当皮质酮升高时可诱使郁闷的产生，因而本研讨选用糖皮质激素——皮质酮诱导郁闷症模型，行为学成果显现，模型组小鼠糖水消耗量削减，悬尾不动时间延伸，自主活动数削减，标明小鼠快感缺少，即造模成功；怀菊花提取物可以不同程度地改进小鼠的郁闷行为。
单胺类神经递质假说是现在公认的郁闷症发病机制之一， 5-HT 、 NE 和 DA 在心情、认知、学习、运动活动、警惕、奖赏、睡觉和胃口等方面发挥着重要效果 [14] ，它们在脑内分泌的削减将会影响神经信号的传导，然后产生郁闷心情。因而，添加脑内突触空隙的神经递质水平是缓解郁闷症的途径之一 [15] 。研讨发现，郁闷症患者脑内和血清中 5-HT 、 NE 和 DA 水均匀下降 [16] 。本研讨成果显现，模型组血清中神经递质水均匀下降，怀菊花提取物可以经过调理神经递质水平来缓解郁闷症。
cAMP/CREB/BDNF 信号通路在郁闷症中起着要害效果，且与增强认知有关 [17] 。 cAMP 作为第二信使与其下流 CREB 结合， CREB 是细胞内重要的转录因子，可以调理多巴胺能神经元及 BDNF 表达 [17] 。神经养分假说以为郁闷的产生与 BDNF 表达削减有关。研讨发现，海马安排 BDNF 信号受损可致郁闷，给予抗郁闷药物医治后，海马安排 BDNF 表达升高 [18] 。本研讨发现，模型组海马安排中 CREB 、 p-CREB 、 cAMP 、 BDNF 蛋白表达水均匀显着下降，怀菊花提取物组以上蛋白的表达均显着升高，标明怀菊花可以经过调理 cAMP/CREB/BDNF 信号通路发挥抗郁闷效果。此外，继续地激活 HPA 轴，会形成机体稳态失衡，由此改动神经生化物质，导致大脑产生器质性的改变 [9] 。郁闷症、 ROS 与神经细胞凋亡之间联络亲近 [19] 。因而，选用流式细胞术和 In-Cell Western 技能别离检测细胞凋亡和凋亡蛋白表达状况，成果显现，怀菊花提取物可以按捺皮质酮诱导的细胞凋亡。此外，本研讨发现，皮质酮可以影响小鼠胸腺安排，标明郁闷的产生与免疫体系有必定的联络，估测怀菊花可以在必定程度上调理机体的免疫体系。
归纳，怀菊花在体表里均可以有用缓解郁闷模型的相关目标，提示其或许是抗郁闷的潜在药物，怀菊花提取物或许经过调理 CREB 通路、按捺神经细胞凋亡，然后改进郁闷。
来 源：卢仁睿，张 莉，徐瑞豪，王慧慧，冯卫生，郑晓珂．怀菊花提取物对皮质酮诱导的郁闷模型的维护效果及机制研讨 [J]. 中草药, 2022, 53(18): 5750-5758 .
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